斑馬魚胚胎(tai)顯(xian)微注射實驗操(cao)作(zuo)方法

顯微(wei)注射技術(shu)是在顯微(wei)鏡(jing)下，利用(yong)顯微(wei)操(cao)作系統，控制顯微(wei)注射針在顯微(wei)鏡(jing)視野內移動，對進行細胞或早期胚胎操(cao)作的(de)一(yi)(yi)種(zhong)方法。該技術(shu)已經在越來越多的(de)實驗生物學研究領域中成為(wei)一(yi)(yi)項普遍的(de)操(cao)作技術(shu)，并成功運(yun)用(yong)于(yu)包(bao)括小鼠、大鼠、兔(tu)子、斑馬魚及許多大型家(jia)畜(chu)，如牛(niu)、羊、豬等動物中。

斑馬魚顯微注射(she)是將實(shi)驗材料直接注射(she)到(dao)1-4細胞期(qi)的(de)斑馬(ma)魚胚胎中(zhong)，由于在這個胚胎發育(yu)早(zao)期(qi)沒(mei)有膜分隔細胞和卵黃，注入1個細(xi)胞(bao)或卵黃的溶液(ye)將擴散到(dao)整(zheng)個胚(pei)胎中。通過注射(she)不同類型的實驗(yan)樣品(pin)，實現基(ji)因的瞬時(shi)過表(biao)達（over-expression）、表達敲(qiao)減（knock-down）、以及制(zhi)備轉基(ji)因或突變斑馬魚品系等研究。

一、   胚胎顯(xian)微注射技術的(de)應用

斑馬魚(yu)作(zuo)為一種新興的(de)(de)理想(xiang)的(de)(de)模式生(sheng)物，在生(sheng)命科學研(yan)究中(zhong)已得到廣泛應用，斑馬魚(yu)胚(pei)胎顯微(wei)注(zhu)(zhu)射技術(shu)(shu)是這些應用研(yan)究的(de)(de)基礎技術(shu)(shu)平(ping)臺之一。通過(guo)顯微(wei)注(zhu)(zhu)射不(bu)同的(de)(de)實驗樣品，可以實現以下不(bu)同的(de)(de)目的(de)(de)。

（一(yi)）可以通過注射體外合成的mRNA實現目的(de)基因的(de)過(guo)表達，并通過(guo)觀察表型(xing)推(tui)測目的(de)基因的(de)功(gong)能。

（二）可(ke)以通過注(zhu)射反(fan)義(yi)嗎啉環寡(gua)核苷酸（morpholino）敲減目(mu)的(de)基因的(de)表達(da)。morpholino是穩(wen)定的(de)(de)人(ren)工合成的(de)(de)核酸(suan)類似(si)物，通過標準的(de)(de)堿(jian)基互(hu)補配對與mRNA結(jie)合，阻斷蛋白翻(fan)譯(yi)或mRNA剪切。與(yu)過(guo)表達(da)相(xiang)反(fan)，這(zhe)種方法導致mRNA蛋(dan)白(bai)產物(wu)減少，可以通過該(gai)蛋(dan)白(bai)減少時(shi)對生(sheng)物(wu)學過程的改(gai)變來(lai)解釋目的基(ji)因在發育中(zhong)所扮演的角(jiao)色。

（三）基因(yin)敲除（knock-out）品系的研制(zhi)。基因敲除品系是在(zai)活體動(dong)物上開展基因功能研究(jiu)的重要工(gong)具。CRISPR-Cas9技(ji)術是一種高效(xiao)、快速(su)的構建敲除品系的新方法(fa)。這個技(ji)術的原(yuan)理是通過人(ren)工設計出sgRNA，sgRNA能夠通過(guo)堿基配對識別目標(biao)序列，然后引導體外(wai)合成的核酸內(nei)切酶(mei)Cas9蛋白在目標靶點(dian)產生切割。DNA斷裂后，細胞將(jiang)通過非同源末端(duan)接合(NHEJ)修(xiu)復機制來進行(xing)修(xiu)復，將斷裂的DNA重新連接起來，在這(zhe)個過程中會產生DNA堿基的插(cha)入或缺失(shi)的錯誤，從(cong)而引起DNA突變(bian)。

（四）轉(zhuan)基(ji)因(yin)品(pin)系(xi)的(de)研制。轉(zhuan)基(ji)因(yin)技術是將人工分離和修(xiu)飾過(guo)的(de)基(ji)因(yin)導入到(dao)生物體基(ji)因(yin)組中，由于導入基(ji)因(yin)的(de)表達，引起生物體的(de)性狀產生可遺傳的(de)修(xiu)飾。在轉(zhuan)基(ji)因(yin)品(pin)系(xi)研制中，轉(zhuan)基(ji)因(yin)載(zai)體是承載(zai)外源(yuan)基(ji)因(yin)，攜帶(dai)靶(ba)基(ji)因(yin)進入斑(ban)(ban)馬魚胚胎細胞，并(bing)將目(mu)的(de)基(ji)因(yin)整合(he)到(dao)斑(ban)(ban)馬魚基(ji)因(yin)組使(shi)其穩定維持的(de)DNA分子。顯微注射是制備轉基因(yin)斑馬魚過程中(zhong)常(chang)用的方(fang)法。

二、 顯微注射系統的搭建

斑馬魚顯(xian)微注射需有一套相(xiang)當精密的顯(xian)微操作設備(bei)，主(zhu)要包括以下(xia)幾種(zhong)（圖4.1）：

圖4.1顯微注射(she)常用設(she)備。A: SUTTERP-1000微電極(ji)拉制儀; B: ASI顯微注射儀MPPI-3;

C: 持針器和(he)顯微(wei)操(cao)作儀MM33; D：體視顯(xian)微鏡

微電(dian)極拉制儀用于拉(la)制(zhi)(zhi)毛細(xi)管成注射(she)針(zhen)，可(ke)以調節的溫度、拉(la)力(li)、拉(la)制(zhi)(zhi)時(shi)間等參數拉(la)制(zhi)(zhi)出合(he)適針(zhen)尖(jian)的注射(she)針(zhen)，為了防止空氣中灰塵顆粒沾染注射(she)針(zhen)引(yin)起針(zhen)尖(jian)阻(zu)塞(sai)，注射(she)針(zhen)現用現拉(la)。

顯微注射(she)儀(yi)用(yong)于注射(she)(she)(she)針(zhen)內(nei)的溶液(ye)施(shi)加壓(ya)力脈沖，利用(yong)可調節氣壓(ya)脈沖將精(jing)準體積的樣品(pin)注射(she)(she)(she)至(zhi)胚胎體內(nei)。注射(she)(she)(she)器還(huan)和(he)一個腳(jiao)踏板(ban)相連，使得實驗人(ren)員在使用(yong)雙(shuang)手的同(tong)時還(huan)可以激活壓(ya)力脈沖將實驗材(cai)料注射(she)(she)(she)入胚胎中；

持針器用(yong)于(yu)固定(ding)在注射(she)過程中(zhong)使用(yong)的(de)注射(she)針，并(bing)將它與注射(she)器(qi)(qi)的(de)空(kong)氣管相(xiang)連，常(chang)裝在顯微操作器(qi)(qi)上；

顯微(wei)操作儀用于注(zhu)射針(zhen)的顯(xian)微操縱，可以(yi)在顯(xian)微注(zhu)射過(guo)程(cheng)中(zhong)對注(zhu)射針(zhen)的位置進行細小和(he)精準地調(diao)節；

體視顯微鏡用于顯(xian)微注射時觀察胚(pei)胎(tai)，可以在顯(xian)微注射過(guo)程中看到胚(pei)胎(tai)并對注射針所在的位置聚焦(jiao)。

三、 顯微(wei)注射過程及注意(yi)事(shi)項(xiang)

顯微(wei)注射技術是一個(ge)相對精細的實驗操作(zuo)，主要有以下步驟。

（一）準備注(zhu)射(she)用的胚胎(tai)

注(zhu)射的(de)前(qian)1DAY，按照雌:雄為1:1或2 :1的比例將成年斑(ban)馬魚放置于(yu)配種缸，用隔板分開(kai)（圖(tu)2.3）。

注(zhu)射的(de)早上(shang)，抽去隔板(ban)，雌(ci)雄(xiong)魚開始交配。一(yi)般在十多分(fen)鐘(zhong)左右親魚產卵并使卵受精。一(yi)般一(yi)次抽板(ban)2缸魚(yu)左右，隨后根(gen)據實(shi)驗進度適時(shi)給其它缸抽板(ban)。可在抽板(ban)前先(xian)將內缸連(lian)同親魚(yu)換到另一干凈(jing)外(wai)缸中(zhong)以節(jie)約(yue)清(qing)潔(jie)胚胎的時(shi)間(jian)。

親魚(yu)產卵后，取180μm孔徑的(de)過(guo)濾網(wang)，收(shou)集外(wai)缸(gang)底部的(de)魚卵(luan)，并(bing)用(yong)養殖(zhi)水清洗魚卵(luan)2-3次。應盡量(liang)收集(ji)20 min內的受精卵（即對(dui)于同一缸親(qin)魚(yu)，兩(liang)次收集受精卵的時間間隔不得超(chao)過20分鐘，以保(bao)證(zheng)發育階段的一致(zhi)性）。受精卵分選和洗凈后，用吸管將(jiang)收集的卵置于平板培(pei)養(yang)皿中，去除平皿內的異物和胚(pei)胎周(zhou)圍的水，采用干法注射。

胚(pei)胎在受精(jing)后10分鐘(zhong)卵膜將膨脹，隨后(hou)數分鐘(zhong)內(nei)細(xi)胞(bao)形態(tai)變得較為規整(zheng)（容(rong)易找到動物極），此時可以開(kai)始注射。受精后(hou)45分鐘左右(you)（標準培育溫度下所(suo)需(xu)時(shi)間，具體情況(kuang)同室(shi)溫有關）發(fa)生一次(ci)卵(luan)裂。樣品通常需(xu)要注射到1-4細胞時期胚胎(tai)，以下上樣、斷針、定(ding)量和注(zhu)射都(dou)要在(zai)此段(duan)時間(jian)內或在(zai)此之前完成。

（二）拉針、上(shang)樣和儀器準備(bei)工(gong)作

1、拉針(zhen)。使用(yong)微電極拉制儀(yi)拉制一定數量的毛細管，應(ying)提前準備(bei)。

2、可以提前準備(bei)，樣品(pin)通(tong)常包括質(zhi)粒(li)DNA、RNA、morpholino等。

DNA質粒樣品：質粒DNA需(xu)使用“去(qu)內毒。素(su)"的試劑盒提取。一般注射量為(wei)每(mei)枚(mei)胚胎20-150pg，多(duo)于200pg胚胎死(si)亡(wang)率上升。

mRNA樣品：一(yi)般注射量為(wei)每(mei)枚胚胎10-500pg，針(zhen)對不同的mRNA樣品(pin)，需要(yao)摸索各(ge)自適宜(yi)的濃度。

Morpholino樣品：參(can)見GeneTools公司隨樣品提(ti)供的(de)說明書。通常產品總量(liang)為300nmol一瓶，約相當于2400μg，加(jia)入200μL滅過菌的去離子水（電阻(zu)率(lv)>18MΩ/cm）稀釋至12μg/μL，每管(guan)20μL分(fen)裝(zhuang)作為儲液(ye)凍(dong)存在－20℃。注射時(shi)取(qu)一(yi)管(guan)稀釋至0.5-6μg/μL (ng/nL)左(zuo)右。針對不同的morpholino，需摸索各自(zi)合適(shi)的濃度，以獲得理想的表(biao)型而(er)不產生毒性(xing)效應(ying)為宜。在使用新的morpholino時，必須慎重考量該morpholino的有效性和特(te)異性。

所有樣(yang)品使用前需要先離心，使可(ke)能(neng)存在(zai)的固體懸浮物沉淀到(dao)管底，避免堵住(zhu)針頭。一般可(ke)以在(zai)注射樣(yang)品中加入終濃度(du)10%-20%的酚(fen)紅，便于觀(guan)察注(zhu)射過程。

3、上樣裝(zhuang)針。將拉制好的(de)毛細管豎直固(gu)定。然后吸取(qu)1-3μl顯微注射(she)液，逐(zhu)滴地將注射(she)液滴在(zai)毛(mao)(mao)細(xi)管(guan)頂端，在(zai)毛(mao)(mao)細(xi)管(guan)內(nei)芯(xin)引導下，液體(ti)通過虹吸作(zuo)用(yong)將匯聚于玻(bo)璃管(guan)針頭部分。如果使用(yong)的毛(mao)(mao)細(xi)管(guan)沒有內(nei)芯(xin)，可以使用(yong)微量上樣(yang)移液槍(qiang)頭上樣(yang)。上樣(yang)體(ti)積(ji)至少為1μL，一定不要在(zai)針內引入空氣柱(zhu)，否則會難以控制注(zhu)射量。

4、打(da)開顯微注射儀。以MPPI-3脈(mo)沖壓力(li)注射儀為例(li)。打開氮(dan)氣罐總閥(fa)，調(diao)節壓力(li)至0-0.5之間。打開(kai)注(zhu)射儀開(kai)關，調(diao)節主操作面(mian)板上(shang)的壓力值為10-20左右(you)，選擇合適(shi)的注(zhu)射壓力和脈沖時間(jian)。（圖4.2）

圖4.2 全套搭建好的顯微注射設備(bei)（左側(ce)）和破針操作（右側(ce)）

（三）注射斑馬魚胚(pei)胎

1、破(po)針。將上好樣品的注射針插入持針器中固定，然后在體視鏡高倍放大率下，用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。（圖4.2）

2、注射劑量(liang)調(diao)整。把臺微尺放置到體視顯微鏡下，加入一滴礦物油，將注射針伸入礦物油中，踩動踏板壓將一滴注射液送到礦物油，測量注射樣品的大小。注射體積與針尖大小、注射壓力、注射時間、溶液粘度和外部壓力有關，理想的注射劑量為胚胎體積的10%，一般為1nL（注射(she)樣品的(de)直徑在10個小格左右）。注射劑量過大體(ti)積會損傷胚胎，過小可能影響定量精準度(du)和擴散的均勻(yun)程(cheng)度(du)。

3、注(zhu)射(she)。將收集的胚胎放置到體視顯微鏡鏡下，用低倍物鏡對準胚胎調焦，輕輕的落下針尖，并將注射針尖推入視野中心，通過微操作系統的微調調整注射針位置，直到清晰見到針尖為止。進一步調整顯微鏡焦距和注射針及胚胎的位置，使胚胎和注射針尖均達到非常清晰程度。推動操縱桿，小心進針，使注射針針尖進入胚胎。腳踏開關將樣品注入胚胎。實驗結束時，先關閉氮氣罐總閥（逆時針變松為關），排空儀器中的氣體后，關閉總開關。

（四）注射胚胎的培養(yang)和觀察

1、胚(pei)胎(tai)養殖。注射結束后，將胚胎轉移至養殖水中，置入28?C培養箱培養。待胚(pei)胎發育(yu)2小時后，顯微鏡下(xia)挑出未(wei)受精的(de)胚(pei)胎(tai)和死(si)亡(wang)的(de)胚(pei)胎(tai)。孵化(hua)期間每天要及(ji)時去除敗育胚(pei)胎(tai)，勤(qin)換水。

2、胚胎麻醉和固(gu)定(ding)。麻醉劑可以使魚類代謝減緩，鰓動頻率下降，氧的需求量減少，從而方便進行實驗操作。通常將斑馬魚浸泡于0.016%的Tricaine中進行麻醉。待胚(pei)胎麻醉后(hou)，利用4%的(de)甲(jia)基纖維素固定胚胎(tai)，將胚胎(tai)調(diao)整到(dao)合適的(de)位(wei)置。廢棄的(de)顯(xian)微注射針(zhen)的(de)尖(jian)兒端燒溶后可以(yi)用(yong)于調(diao)整胚胎(tai)。

3、胚胎觀察(cha)。為了便于觀察顯微注射的結果，本次培訓使用質粒pT2(tpma:EGFP)和chordin mopholino作為(wei)注射練習的材料。質(zhi)粒pT2(tpma:EGFP)注射后，胚胎發育(yu)至1天時，在肌肉中特異表(biao)達(da)綠色熒光蛋白；chordin mopholino注射后的胚胎出現腹部化（ventralization）。（圖4.3）

圖4.3 顯微注射后24hpf胚胎的照片。胚胎發育至1天時，注射質粒pT2(tpma:EGFP)的胚(pei)胎在肌(ji)肉(rou)細胞中特(te)異(yi)表(biao)達(da)綠(lv)色(se)熒光蛋白(bai)（A）；注射chordin mopholino的(de)胚胎產(chan)生腹(fu)部化表型（B）。

顯(xian)微注射的注意(yi)事(shi)項

顯微(wei)注射的操作過程(cheng)中有許多細節影響實驗的成(cheng)功率，需要特別關注，主要包括以下幾方面。

1、注(zhu)射樣品的質量和和濃度。顯微注(zhu)射的樣品種類繁多，包括mRNA、DNA或蛋白質等，但是(shi)注(zhu)(zhu)射(she)樣品是(shi)否純凈是(shi)關系到(dao)注(zhu)(zhu)射(she)效率高低(di)的(de)重要因素(su)之一。此外，注(zhu)(zhu)射(she)樣品的(de)濃度不易太高，例如注(zhu)(zhu)射(she)DNA的總(zong)濃度一般控制(zhi)在200pg以下。

2、注射(she)前小心將顯(xian)微注射(she)針定位(wei)，注射(she)針定位(wei)到(dao)卵表面的(de)注射(she)角度是(shi)穿透堅硬的(de)卵殼注射(she)成功的(de)關(guan)鍵。

3、破針時，將針尖一點(dian)點(dian)剪斷，不宜一次剪太(tai)多。顯微(wei)注射針尖如果太(tai)粗，會(hui)導(dao)致DNA流量過多，受(shou)精卵易于裂解(jie)；太細則導致針內DNA流出速率(lv)過(guo)慢，且易堵(du)塞針尖，而使(shi)DNA無法順利流入(ru)，影響(xiang)注射(she)(she)效率。因此(ci)進(jin)行顯(xian)微(wei)注射(she)(she)時(shi)，如何制備適用的(de)顯(xian)微(wei)注射(she)(she)針是(shi)顯(xian)微(wei)注射(she)(she)效率極其重要的(de)因素(su)。

4、在(zai)注射(she)過程中，常發(fa)生(sheng)注射(she)針(zhen)堵(du)塞，堵(du)塞后，通(tong)常可通(tong)過輕夾針(zhen)尖、增(zeng)大輸出壓力或(huo)按(an)pulse/CONT開關(guan)而得以緩解。如果不能(neng)解決，換(huan)用新的(de)注射針。

5、注射時注射器的壓(ya)力不宜變化太(tai)快(kuai)，否則會造成注射量操作難以控制(zhi)，導致胚胎內環境改(gai)變過快(kuai)過大甚至脹破細(xi)胞。氮氣罐(guan)的壓(ya)力閥顯示氣體的壓(ya)力，壓(ya)力為(wei)0表明罐內無氣體，需(xu)要及時換(huan)氣。

6、注(zhu)射完畢(bi)，慢慢抽出注(zhu)射針，要一(yi)氣呵成，避(bi)免受(shou)精卵內物(wu)質隨著毛細針抽出，造成受(shou)精卵的(de)損傷(shang)。

7、在(zai)整個過程中，嚴(yan)禁將注射針(zhen)(zhen)尖(jian)對(dui)著人(ren)員和儀器(qi)，因為(wei)注射針(zhen)(zhen)在(zai)持針(zhen)(zhen)器(qi)上安(an)裝不牢時或針(zhen)(zhen)尖(jian)堵塞，注射器(qi)、管子及注射針(zhen)(zhen)內(nei)的壓力，可能(neng)將注射針(zhen)(zhen)射出(chu)傷人(ren)。